Προϊόντα
Κιτ ανίχνευσης Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR για 2019-nCoV
Αναμενόμενη χρήση
Αυτό το κιτ χρησιμοποιείται για την ποιοτική ανίχνευση του νέου κορωνοϊού (2019-nCoV) χρησιμοποιώντας επιχρίσματα λαιμού, ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα, υγρό βρογχοκυψελιδικής πλύσης, πτύελα. Το αποτέλεσμα ανίχνευσης αυτού του προϊόντος είναι μόνο για κλινική αναφορά και δεν πρέπει να χρησιμοποιείται ως το μοναδικό στοιχεία για κλινική διάγνωση και θεραπεία. Συνιστάται μια ολοκληρωμένη ανάλυση της κατάστασης σε συνδυασμό με τις κλινικές εκδηλώσεις του ασθενούς και άλλες εργαστηριακές εξετάσεις.
Αρχή επιθεώρησης
Το κιτ βασίζεται στην τεχνολογία RT-PCR ενός βήματος.Στην πραγματικότητα, τα γονίδια ORF1ab και N του νέου κορωνοϊού 2019 (2019-nCoV) επιλέχθηκαν ως οι περιοχές στόχοι ενίσχυσης.Ειδικοί εκκινητές και φθορίζοντες ανιχνευτές (οι ανιχνευτές γονιδίου Ν επισημαίνονται με FAM και οι ανιχνευτές ORF1ab επισημαίνονται με HEX) έχουν σχεδιαστεί για την ανίχνευση RNA του κορωνοϊού νέου τύπου 2019 σε δείγματα.Το κιτ περιλαμβάνει επίσης ένα ενδογενές σύστημα ανίχνευσης εσωτερικού ελέγχου (γονιδιακός ανιχνευτής εσωτερικού ελέγχου σημασμένο με CY5) για την παρακολούθηση της διαδικασίας συλλογής δειγμάτων, ενίσχυσης RNA και PCR, μειώνοντας έτσι τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.
Κύρια εξαρτήματα
| Συστατικά | Ενταση ΗΧΟΥ(48Τ/Κιτ) |
| Διάλυμα αντίδρασης RT-PCR | 96μl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864 μl |
| Αρνητικός έλεγχος | 1500 μl |
| nCOV Θετικός έλεγχος (l γονίδιο ORF1ab N) | 1500 μl |
Δικά του αντιδραστήρια: αντιδραστήρια εκχύλισης ή καθαρισμού RNA.Αρνητικός/θετικός μάρτυρας: Ο θετικός έλεγχος είναι το RNA που περιέχει το θραύσμα στόχο, ενώ ο αρνητικός έλεγχος είναι νερό χωρίς νουκλεϊκό οξύ.Κατά τη χρήση, θα πρέπει να συμμετέχουν στην εξαγωγή και να θεωρούνται μολυσματικά.Ο χειρισμός και η απόρριψή τους πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους σχετικούς κανονισμούς.
Το εσωτερικό γονίδιο αναφοράς είναι το ανθρώπινο γονίδιο RnaseP.
Συνθήκες αποθήκευσης και ημερομηνία λήξης
-20±5℃, αποφύγετε την επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη περισσότερες από 5 φορές, ισχύει για 6 μήνες.
Εφαρμοστέο όργανο
Με FAM / HEX / CY5 και άλλο πολυκάναλο φθορίζον όργανο PCR.
Απαιτήσεις δείγματος
1. Εφαρμόσιμοι τύποι δειγμάτων: επιχρίσματα λαιμού, ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα, βρογχοκυψελιδικό υγρό πλύσης, πτύελα.
2. Συλλογή δειγμάτων (άσηπτη τεχνική)
Φάρυγγα: Σκουπίστε τις αμυγδαλές και το οπίσθιο φαρυγγικό τοίχωμα με δύο επιχρίσματα ταυτόχρονα και, στη συνέχεια, βυθίστε την κεφαλή του στυλεού σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει το διάλυμα δειγματοληψίας
Πτύελα: Αφού ο ασθενής έχει βαθύ βήχα, συλλέξτε τα πτύελα που έχουν βήξει σε δοκιμαστικό σωλήνα με βιδωτό καπάκι που περιέχει το διάλυμα δειγματοληψίας.Υγρό βρογχοκυψελιδικής πλύσης: Δειγματοληψία από επαγγελματίες γιατρούς.3.Αποθήκευση και μεταφορά δειγμάτων
Τα δείγματα για απομόνωση ιού και δοκιμή RNA θα πρέπει να ελέγχονται το συντομότερο δυνατό.Τα δείγματα που μπορούν να ανιχνευθούν εντός 24 ωρών μπορούν να αποθηκευτούν στους 4℃.αυτά που δεν μπορούν να εντοπιστούν εντός 24
Οι ώρες θα πρέπει να αποθηκεύονται στους -70℃ ή χαμηλότερα (εάν δεν υπάρχουν συνθήκες αποθήκευσης -70℃, θα πρέπει να
φυλάσσεται προσωρινά στους -20℃ ψυγείο).Τα δείγματα πρέπει να αποφεύγουν την επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη κατά τη μεταφορά.Τα δείγματα πρέπει να αποστέλλονται στο εργαστήριο το συντομότερο δυνατό μετά τη συλλογή.Εάν τα δείγματα πρέπει να μεταφερθούν σε μεγάλες αποστάσεις, συνιστάται η αποθήκευση ξηρού πάγου.
Μέθοδοι δοκιμής
1 Επεξεργασία δειγμάτων και εξαγωγή RNA (περιοχή επεξεργασίας δείγματος)
Συνιστάται η λήψη 200μl υγρού δείγματος για εξαγωγή RNA.Για σχετικά βήματα εκχύλισης, ανατρέξτε στις οδηγίες των εμπορικών κιτ εκχύλισης RNA.Και τα αρνητικά και τα αρνητικά
Οι έλεγχοι σε αυτό το κιτ συμμετείχαν στην εξαγωγή.
2 Παρασκευή αντιδραστηρίου PCR (περιοχή προετοιμασίας αντιδραστηρίου)
2.1 Αφαιρέστε όλα τα εξαρτήματα από το κιτ και ξεπαγώστε και ανακατέψτε σε θερμοκρασία δωματίου.Φυγοκεντρήστε στις 8.000 rpm για λίγα δευτερόλεπτα πριν τη χρήση.υπολογίστε την απαιτούμενη ποσότητα αντιδραστηρίων και το σύστημα αντίδρασης προετοιμάζεται όπως φαίνεται στον ακόλουθο πίνακα:
| Συστατικά | Μερίδα N (σύστημα 25 μl) |
| nCOV primer TaqMan probemix | 18 μl × Ν |
| Διάλυμα αντίδρασης RT-PCR | 2 μl × Ν |
| *N = αριθμός δειγμάτων που δοκιμάστηκαν + 1 (αρνητικός έλεγχος) + 1 (nCOVθετικός έλεγχος) | |
2.2 Αφού αναμίξετε καλά τα συστατικά, φυγοκεντρήστε για μικρό χρονικό διάστημα ώστε όλο το υγρό στο τοίχωμα του σωλήνα να πέσει στον πυθμένα του σωλήνα και, στη συνέχεια, κατανεμήστε το σύστημα ενίσχυσης 20 µl στο σωληνάριο PCR.
3 Δειγματοληψία (περιοχή προετοιμασίας δείγματος)
Προσθέστε 5 μl αρνητικού και θετικού ελέγχου μετά την εκχύλιση.Το RNA του προς δοκιμή δείγματος προστίθεται στο σωληνάριο αντίδρασης PCR.
Καλύψτε καλά τον σωλήνα και φυγοκεντρήστε στις 8.000 rpm για λίγα δευτερόλεπτα πριν τον μεταφέρετε στην περιοχή ανίχνευσης ενίσχυσης.
4 Ενίσχυση PCR (ενισχυμένη περιοχή ανίχνευσης)
4.1 Τοποθετήστε το σωλήνα αντίδρασης στο κελί δείγματος του οργάνου και ρυθμίστε τις παραμέτρους ως εξής:
| στάδιο | Κύκλος αριθμός | Θερμοκρασία(°C) | χρόνος | συλλογήιστοσελίδα |
| ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗμεταγραφή | 1 | 42 | 10 λεπτά | - |
| Προ-μετουσιωτισμόςn | 1 | 95 | 1 λεπτό | - |
| Κύκλος | 45 | 95 | 15 δευτ | - |
| 60 | δεκαετία του '30 | συλλογή δεδομένων |
Επιλογή καναλιού ανίχνευσης οργάνου: Επιλέξτε το κανάλι FAM, HEX, CY5 για το σήμα φθορισμού.Για αναφορά φθορισμού ΚΑΜΙΑ, παρακαλώ μην επιλέξετε ROX.
5 Ανάλυση αποτελεσμάτων (Ανατρέξτε στις πειραματικές οδηγίες κάθε οργάνου για τη ρύθμιση)
Μετά την αντίδραση, αποθηκεύστε τα αποτελέσματα.Μετά την ανάλυση, προσαρμόστε την αρχική τιμή, την τελική τιμή και την τιμή κατωφλίου της γραμμής βάσης σύμφωνα με την εικόνα (ο χρήστης μπορεί να προσαρμόσει ανάλογα με την πραγματική κατάσταση, η αρχική τιμή μπορεί να οριστεί σε 3~15, η τιμή λήξης μπορεί να οριστεί σε 5~20, προσαρμογή) στο λογαριθμικό γράφημα Στο κατώφλι του παραθύρου, η γραμμή κατωφλίου βρίσκεται στη λογαριθμική φάση και η καμπύλη ενίσχυσης του αρνητικού ελέγχου είναι μια ευθεία γραμμή ή κάτω από τη γραμμή κατωφλίου).
6 Ποιοτικός έλεγχος (Ένας διαδικαστικός έλεγχος περιλαμβάνεται στη δοκιμή) Αρνητικός έλεγχος: Καμία προφανής καμπύλη ενίσχυσης για κανάλια ανίχνευσης FAM, HEX, CY5n
Θετικός έλεγχος COV: εμφανής καμπύλη ενίσχυσης καναλιών ανίχνευσης FAM και HEX, τιμή Ct≤32, αλλά όχι καμπύλη ενίσχυσης καναλιού CY5.
Οι παραπάνω απαιτήσεις πρέπει να πληρούνται ταυτόχρονα στο ίδιο πείραμα.Διαφορετικά, το πείραμα δεν είναι έγκυρο και πρέπει να επαναληφθεί.
7 Προσδιορισμός αποτελεσμάτων.
7.1 Εάν δεν υπάρχει καμπύλη ενίσχυσης ή τιμή Ct> 40 στα κανάλια FAM και HEX του δείγματος δοκιμής και υπάρχει καμπύλη ενίσχυσης στο κανάλι CY5, μπορεί να κριθεί ότι δεν υπάρχει νέος κορωνοϊός 2019 (2019-nCoV) RNA στο δείγμα.
.2 Εάν το δείγμα δοκιμής έχει εμφανείς καμπύλες ενίσχυσης στα κανάλια FAM και HEX και η τιμή Ct είναι ≤40, μπορεί να κριθεί ότι το δείγμα είναι θετικό για τον νέο κοροναϊό του 2019 (2019-nCoV).
7.3 Εάν το δείγμα δοκιμής έχει καθαρή καμπύλη ενίσχυσης μόνο σε ένα κανάλι FAM ή HEX και η τιμή Ct είναι ≤40 και δεν υπάρχει καμπύλη ενίσχυσης στο άλλο κανάλι, τα αποτελέσματα πρέπει να επανεξεταστούν.Εάν τα αποτελέσματα της επανεξέτασης είναι συνεπή, το δείγμα μπορεί να κριθεί θετικό για το νέο
κορωνοϊός 2019 (2019-nCoV).Εάν το αποτέλεσμα της επανάληψης της δοκιμής είναι αρνητικό, μπορεί να κριθεί ότι το δείγμα είναι αρνητικό για τον νέο κορωνοϊό του 2019 (2019-nCoV).
Θετική αξία κρίσης
Η μέθοδος της καμπύλης ROC χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της τιμής CT αναφοράς του κιτ και η τιμή αναφοράς εσωτερικού ελέγχου είναι 40.
Ερμηνεία των αποτελεσμάτων των δοκιμών
1.Κάθε πείραμα θα πρέπει να ελέγχεται για αρνητικούς και θετικούς μάρτυρες.Τα αποτελέσματα των δοκιμών μπορούν να προσδιοριστούν μόνο όταν οι έλεγχοι πληρούν τις απαιτήσεις ποιοτικού ελέγχου
2.Όταν τα κανάλια ανίχνευσης FAM και HEX είναι θετικά, το αποτέλεσμα από το κανάλι CY5 (κανάλι εσωτερικού ελέγχου) μπορεί να είναι αρνητικό λόγω του ανταγωνισμού του συστήματος.
3. Όταν το αποτέλεσμα εσωτερικού ελέγχου είναι αρνητικό, εάν τα κανάλια ανίχνευσης FAM και HEX του δοκιμαστικού σωλήνα είναι επίσης αρνητικά, σημαίνει ότι το σύστημα είναι απενεργοποιημένο ή η λειτουργία είναι λανθασμένη, η δοκιμή είναι άκυρη.Επομένως, τα δείγματα πρέπει να επανεξεταστούν.
