Προϊόντα
Κιτ ανίχνευσης Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR για τον 2019-nCoV
Αναμενόμενη χρήση
Αυτό το κιτ χρησιμοποιείται για την ποιοτική ανίχνευση του νέου κορωνοϊού (2019-nCoV) χρησιμοποιώντας φαρυγγικά επιχρίσματα, ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα, υγρό βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης, πτύελα. Το αποτέλεσμα ανίχνευσης αυτού του προϊόντος προορίζεται μόνο για κλινική αναφορά και δεν πρέπει να χρησιμοποιείται ως το μόνο στοιχείο για κλινική διάγνωση και θεραπεία. Συνιστάται μια ολοκληρωμένη ανάλυση της πάθησης σε συνδυασμό με τις κλινικές εκδηλώσεις του ασθενούς και άλλες εργαστηριακές εξετάσεις.
Αρχή επιθεώρησης
Το κιτ βασίζεται στην τεχνολογία RT-PCR ενός βήματος. Στην πραγματικότητα, τα γονίδια ORF1ab και N του νέου κορονοϊού του 2019 (2019-nCoV) επιλέχθηκαν ως περιοχές-στόχοι ενίσχυσης. Ειδικοί εκκινητές και φθορίζοντες ανιχνευτές (οι ανιχνευτές γονιδίων N είναι επισημασμένοι με FAM και οι ανιχνευτές ORF1ab είναι επισημασμένοι με HEX) έχουν σχεδιαστεί για την ανίχνευση RNA του νέου τύπου κορονοϊού του 2019 σε δείγματα. Το κιτ περιλαμβάνει επίσης ένα ενδογενές σύστημα ανίχνευσης εσωτερικού ελέγχου (ανιχνευτής γονιδίου εσωτερικού ελέγχου επισημασμένος με CY5) για την παρακολούθηση της διαδικασίας συλλογής δειγμάτων, ενίσχυσης RNA και PCR, μειώνοντας έτσι τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.
Κύρια εξαρτήματα
| Στοιχεία | Τόμος（48T/Κιτ） |
| Διάλυμα αντίδρασης RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | 864µl |
| Αρνητικός έλεγχος | 1500µl |
| nCOV Θετικός έλεγχος (l γονίδιο ORF1ab N) | 1500µl |
Αντιδραστήρια ίδιας χρήσης: Αντιδραστήρια εκχύλισης ή καθαρισμού RNA. Αρνητικός/θετικός έλεγχος: Ο θετικός έλεγχος είναι RNA που περιέχει το θραύσμα-στόχο, ενώ ο αρνητικός έλεγχος είναι νερό χωρίς νουκλεϊκό οξύ. Κατά τη χρήση, θα πρέπει να συμμετέχουν στην εκχύλιση και να θεωρούνται μολυσματικά. Θα πρέπει να χειρίζονται και να απορρίπτονται σύμφωνα με τους σχετικούς κανονισμούς.
Το εσωτερικό γονίδιο αναφοράς είναι το ανθρώπινο γονίδιο RnaseP.
Συνθήκες αποθήκευσης και ημερομηνία λήξης
-20±5℃, αποφύγετε την επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη περισσότερες από 5 φορές, ισχύει για 6 μήνες.
Εφαρμοστέο μέσο
Με FAM / HEX / CY5 και άλλο όργανο φθορισμού PCR πολλαπλών καναλιών.
Απαιτήσεις δειγμάτων
1. Εφαρμόσιμοι τύποι δειγμάτων: φαρυγγικά επιχρίσματα, ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα, υγρό βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης, πτύελα.
2. Συλλογή δειγμάτων (ασηπτική τεχνική)
Φαρυγγικό στυλεό: Σκουπίστε τις αμυγδαλές και το οπίσθιο φάρυγγα με δύο στυλεούς ταυτόχρονα και, στη συνέχεια, βυθίστε την κεφαλή του στυλεού σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει το διάλυμα δειγματοληψίας.
Πτύελα: Αφού ο ασθενής βήξει βαθιά, συλλέξτε τα πτύελα που προέκυψαν από τον βήχα σε δοκιμαστικό σωλήνα με βιδωτό καπάκι που περιέχει το διάλυμα δειγματοληψίας. Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα: Δειγματοληψία από επαγγελματίες υγείας. 3. Αποθήκευση και μεταφορά δειγμάτων
Τα δείγματα για απομόνωση ιού και έλεγχο RNA θα πρέπει να εξετάζονται το συντομότερο δυνατό. Τα δείγματα που μπορούν να ανιχνευθούν εντός 24 ωρών μπορούν να αποθηκευτούν στους 4℃. Αυτά που δεν μπορούν να ανιχνευθούν εντός 24 ωρών
ώρες θα πρέπει να φυλάσσονται στους -70℃ ή χαμηλότερα (εάν δεν υπάρχουν συνθήκες αποθήκευσης στους -70℃, θα πρέπει να
προσωρινά αποθηκευμένο σε ψυγείο -20℃). Τα δείγματα πρέπει να αποφεύγουν την επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη κατά τη μεταφορά. Τα δείγματα πρέπει να αποστέλλονται στο εργαστήριο το συντομότερο δυνατό μετά τη συλλογή. Εάν τα δείγματα πρέπει να μεταφερθούν σε μεγάλες αποστάσεις, συνιστάται η αποθήκευση σε ξηρό πάγο.
Μέθοδοι δοκιμής
1 Επεξεργασία δειγμάτων και εξαγωγή RNA (περιοχή επεξεργασίας δειγμάτων)
Συνιστάται η λήψη 200 μl υγρού δείγματος για την εκχύλιση RNA. Για τα σχετικά βήματα εκχύλισης, ανατρέξτε στις οδηγίες των εμπορικών κιτ εκχύλισης RNA. Τόσο το αρνητικό όσο και το αρνητικό
Οι έλεγχοι σε αυτό το κιτ συμμετείχαν στην εκχύλιση.
2 Προετοιμασία αντιδραστηρίου PCR (περιοχή προετοιμασίας αντιδραστηρίου)
2.1 Αφαιρέστε όλα τα εξαρτήματα από το κιτ, αποψύξτε και αναμίξτε σε θερμοκρασία δωματίου. Φυγοκεντρήστε στις 8.000 στροφές/λεπτό για λίγα δευτερόλεπτα πριν από τη χρήση. Υπολογίστε την απαιτούμενη ποσότητα αντιδραστηρίων και το σύστημα αντίδρασης παρασκευάζεται όπως φαίνεται στον ακόλουθο πίνακα:
| Στοιχεία | Μερίδα N (σύστημα 25µl) |
| nCOV primer TaqMan probemix | 18 µl × N |
| Διάλυμα αντίδρασης RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = αριθμός δειγμάτων που εξετάστηκαν + 1 (αρνητικός έλεγχος) + 1 (nCOVθετικός έλεγχος) | |
2.2 Αφού αναμίξετε πλήρως τα συστατικά, φυγοκεντρήστε για μικρό χρονικό διάστημα ώστε να πέσει όλο το υγρό στο τοίχωμα του σωλήνα στον πυθμένα του σωλήνα και, στη συνέχεια, κατανείμετε το σύστημα ενίσχυσης των 20 µl στο σωλήνα PCR.
3 Δειγματοληψία (περιοχή προετοιμασίας δειγμάτων)
Προσθέστε 5 μl από τους αρνητικούς και θετικούς μάρτυρες μετά την εκχύλιση. Το RNA του δείγματος που θα εξεταστεί προστίθεται στον σωλήνα αντίδρασης PCR.
Κλείστε καλά το σωληνάριο και φυγοκεντρήστε στις 8.000 στροφές/λεπτό για λίγα δευτερόλεπτα πριν το μεταφέρετε στην περιοχή ανίχνευσης ενίσχυσης.
4 Ενίσχυση PCR (ενισχυμένη περιοχή ανίχνευσης)
4.1 Τοποθετήστε τον σωλήνα αντίδρασης στην κυψελίδα δείγματος του οργάνου και ρυθμίστε τις παραμέτρους ως εξής:
| στάδιο | Κύκλος αριθμός | Θερμοκρασία(°C) | Φορά | συλλογήτοποθεσία |
| Αντίστροφομεταγραφή | 1 | 42 | 10 λεπτά | - |
| Προ-μετουσίωσηn | 1 | 95 | 1 λεπτό | - |
| Κύκλος | 45 | 95 | 15 δευτερόλεπτα | - |
| 60 | δεκαετία του '30 | συλλογή δεδομένων |
Επιλογή καναλιού ανίχνευσης οργάνου: Επιλέξτε το κανάλι FAM, HEX, CY5 για το σήμα φθορισμού. Για φθορισμό αναφοράς NONE, μην επιλέξετε ROX.
5 Ανάλυση αποτελεσμάτων (Ανατρέξτε στις πειραματικές οδηγίες κάθε οργάνου για τη ρύθμιση)
Μετά την αντίδραση, αποθηκεύστε τα αποτελέσματα. Μετά την ανάλυση, προσαρμόστε την αρχική τιμή, την τελική τιμή και την τιμή κατωφλίου της γραμμής βάσης σύμφωνα με την εικόνα (ο χρήστης μπορεί να προσαρμόσει ανάλογα με την πραγματική κατάσταση, η αρχική τιμή μπορεί να οριστεί σε 3~15, η τελική τιμή μπορεί να οριστεί σε 5~20, προσαρμογή) στο λογαριθμικό γράφημα. Στο κατώφλι του παραθύρου, η γραμμή κατωφλίου βρίσκεται στη λογαριθμική φάση και η καμπύλη ενίσχυσης του αρνητικού ελέγχου είναι μια ευθεία γραμμή ή κάτω από τη γραμμή κατωφλίου).
6 Έλεγχος ποιότητας (Στη δοκιμή περιλαμβάνεται έλεγχος διαδικασίας) Αρνητικός έλεγχος: Δεν υπάρχει εμφανής καμπύλη ενίσχυσης για τα κανάλια ανίχνευσης FAM, HEX, CY5
Θετικός έλεγχος COV: εμφανής καμπύλη ενίσχυσης των καναλιών ανίχνευσης FAM και HEX, τιμή Ct≤32, αλλά καμία καμπύλη ενίσχυσης του καναλιού CY5.
Οι παραπάνω προϋποθέσεις πρέπει να πληρούνται ταυτόχρονα στο ίδιο πείραμα, διαφορετικά το πείραμα είναι άκυρο και πρέπει να επαναληφθεί.
7 Προσδιορισμός αποτελεσμάτων.
7.1 Εάν δεν υπάρχει καμπύλη ενίσχυσης ή τιμή Ct> 40 στα κανάλια FAM και HEX του δείγματος δοκιμής και υπάρχει καμπύλη ενίσχυσης στο κανάλι CY5, μπορεί να κριθεί ότι δεν υπάρχει RNA του νέου κορονοϊού 2019 (2019-nCoV) στο δείγμα.
.2 Εάν το δείγμα δοκιμής έχει εμφανείς καμπύλες ενίσχυσης στα κανάλια FAM και HEX και η τιμή Ct είναι ≤40, μπορεί να κριθεί ότι το δείγμα είναι θετικό για τον νέο κορωνοϊό του 2019 (2019-nCoV).
7.3 Εάν το δείγμα δοκιμής έχει σαφή καμπύλη ενίσχυσης μόνο σε ένα κανάλι FAM ή HEX, και η τιμή Ct είναι ≤40, και δεν υπάρχει καμπύλη ενίσχυσης στο άλλο κανάλι, τα αποτελέσματα πρέπει να επανεξεταστούν. Εάν τα αποτελέσματα της επανεξέτασης είναι συνεπή, το δείγμα μπορεί να κριθεί θετικό για το νέο
κορωνοϊός 2019 (2019-nCoV). Εάν το αποτέλεσμα της επανεξέτασης είναι αρνητικό, μπορεί να κριθεί ότι το δείγμα είναι αρνητικό για τον νέο κορωνοϊό του 2019 (2019-nCoV).
Θετική αξία κρίσης
Η μέθοδος της καμπύλης ROC χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της τιμής αναφοράς CT του κιτ και η τιμή αναφοράς του εσωτερικού ελέγχου είναι 40.
Ερμηνεία των αποτελεσμάτων των δοκιμών
1. Κάθε πείραμα θα πρέπει να ελέγχεται για αρνητικούς και θετικούς μάρτυρες. Τα αποτελέσματα των δοκιμών μπορούν να προσδιοριστούν μόνο όταν οι μάρτυρες πληρούν τις απαιτήσεις ποιοτικού ελέγχου.
2. Όταν τα κανάλια ανίχνευσης FAM και HEX είναι θετικά, το αποτέλεσμα από το κανάλι CY5 (κανάλι εσωτερικού ελέγχου) ενδέχεται να είναι αρνητικό λόγω ανταγωνισμού του συστήματος.
3. Όταν το αποτέλεσμα του εσωτερικού ελέγχου είναι αρνητικό, εάν τα κανάλια ανίχνευσης FAM και HEX του δοκιμαστικού σωλήνα είναι επίσης αρνητικά, αυτό σημαίνει ότι το σύστημα είναι απενεργοποιημένο ή η λειτουργία είναι λανθασμένη, δηλαδή η δοκιμή είναι άκυρη. Επομένως, τα δείγματα πρέπει να εξεταστούν ξανά.
